Università degli studi dell'Insubria

METODOLOGIE BIOCHIMICHE

A.A. di erogazione 2017/2018
Insegnamento obbligatorio

Laurea triennale in BIOTECNOLOGIE
 (A.A. 2015/2016)

Docenti

Anno di corso: 
3
Tipologia di insegnamento: 
Caratterizzante
Settore disciplinare: 
BIOCHIMICA (BIO/10)
Crediti: 
6
Ciclo: 
Primo Semestre
Ore di attivita' frontale: 
60
Dettaglio ore: 
Lezione (36 ore), Laboratorio (24 ore)

L’insegnamento di Metodologie Biochimiche si colloca al primo semestre del terzo anno e ha lo scopo di descrivere i principi teorici di funzionamento e le principali applicazioni pratiche delle maggiori metodiche preparative e analitiche attualmente utilizzate nel campo della ricerca biochimica e biologico-molecolare. Nel Corso di Metodologie Biochimiche vengono spiegati i possibili diversi utilizzi di ciascuna delle tecniche descritte, anche con l’utilizzo di esempi comuni nella pratica del laboratorio di biochimica, con lo scopo di fornire agli studenti la possibilità di imparare a scegliere le migliori soluzioni ai problemi teorici e pratici che ci si trova ad affrontare nella pianificazione e nell’esecuzione degli esperimenti.
Al termine del Corso lo studente sarà in grado di:
- conoscere le basi chimiche e strumentali delle principali metodologie analitiche e preparative delle biomolecole;
- valutare le migliori soluzioni per il raggiungimento degli obiettivi sperimentali definiti in fase di pianificazione degli esperimenti;
- svolgere praticamente gli esperimenti affrontati nella parte in laboratorio;
- comprendere e discutere criticamente i risultati sperimentali ottenuti anche allo scopo di utilizzarli come base di partenza per la pianificazione e la realizzazione degli esperimenti successivi;
- comunicare, con obiettività e un linguaggio scientifico adeguato, le informazioni e i risultati sperimentali ottenuti e trarre da essi le opportune conclusioni;
- utilizzare le conoscenze acquisite per valutare criticamente gli obiettivi e/o i risultati di un progetto di ricerca di ambito biochimico secondo sia l’approccio quantitativo che qualitativo.

Per la comprensione degli argomenti trattati nel Corso sono necessarie conoscenze di Chimica Generale, Chimica Organica, Biochimica e Fisica.

Parte teorica:
Per ciascuna delle tecniche sotto elencate vengono forniti i principi teorici e adeguati esempi di applicazione in campo biochimico.
- La progettazione dell'indagine biochimica. Unità di misura, concentrazione e attività. Tecniche preparative e analitiche. Scelta del metodo analitico. Errori sperimentali e metodi di calibrazione. Cenni su colture di microrganismi e di cellule animali.
- Metodi per l’espressione eterologa e l’ingegnerizzazione delle proteine ricombinanti.
- Tecniche elettrochimiche: misura del pH e del consumo di ossigeno (elettrodo di Clark).
- Centrifugazione. Equazioni della sedimentazione. Tipi di centrifughe e di rotori. Centrifugazione preparativa differenziale e in gradiente. Ultracentrifugazione analitica.
- Purificazione delle proteine: metodi per la rottura delle cellule e dei tessuti. Parametri di una purificazione: attività specifica, grado di purificazione e resa. Metodi per la determinazione della concentrazione proteica. Passaggi preliminari di purificazione: chiarificazione, dialisi, precipitazione al calore e al pH, frazionamento con sali o solventi organici. Concentrazione per ultrafiltrazione.
- Tecniche cromatografiche: principi generali. I componenti di un sistema cromatografico. Tipi di cromatografie (a partizione, idrofobica, a scambio ionico, per affinità). FPLC. HPLC: rette di calibrazione, standard esterni e interni.
- Tecniche elettroforetiche. Elettroforesi di acidi nucleici e proteine. SDS-PAGE, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale e capillare. Western blot.
- Tecniche spettroscopiche. Spettrofotometria UV-Vis e IR. Spettrofluorimetria. Dicroismo Circolare. Cenni su altre tecniche spettroscopiche (Raggi-X, NMR, EPR).
- Tecniche immunochimiche.
- Tecniche radioisotopiche: cenni al decadimento delle sostanze radioattive. Misurazione della radioattività in campioni solidi e liquidi. Camere di ionizzazione, contatore Geiger e metodi basati sulla scintillazione. Autoradiografie. Cenni sulla protezione dalle radiazioni.
- Spettrometria di massa.
- Esempi pratici di pianificazione e realizzazione di progetti di ricerca volti all’ottenimento di enzimi ingegnerizzati per applicazioni industriali e mediche.

Attività pratiche in laboratorio:
L’attività pratica in laboratorio riguarderà la purificazione e la caratterizzazione biochimica di un enzima ricombinante. Tutte le attività verranno svolte alla presenza e sotto la supervisione del docente.
- Introduzione teorica e descrizione pratica delle attività sperimentali.
- Rottura delle cellule e ottenimento dell’estratto grezzo. Retta di calibrazione del reattivo del biureto.
- Purificazione dell’enzima dall’estratto grezzo mediante cromatografia di affinità. Dosaggio della concentrazione delle proteine totali nell’estratto grezzo mediante il metodo del reattivo del biureto.
- Determinazione dell’attività enzimatica nell’estratto grezzo e nell’enzima purificato mediante dosaggio accoppiato con metodo colorimetrico. Determinazione della concentrazione dell’enzima puro mediante metodo spettrofotometrico.
- Calcolo dei parametri della purificazione: resa, attività specifica, fattore di purificazione.
- Analisi elettroforetica mediante PAGE in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) e trasferimento delle proteine su membrana di nitrocellulosa (Western blot). Immunodecorazione con anticorpi specifici.
- Determinazione della massa molecolare dell’enzima purificato mediante retta di calibrazione ottenuta dall’analisi dell’SDS-PAGE.
- Determinazione dei parametri cinetici allo stato stazionario.
- Determinazione dell’attività enzimatica su substrati alternativi.
- Discussione e analisi critica dei risultati ottenuti.

Il Corso prevede 36 ore di lezioni frontali, tutte impartite dal docente titolare del Corso, e 24 ore di attività pratiche in laboratorio. Per le attività pratiche, gli studenti saranno divisi in piccoli gruppi e saranno fornite a ciascun studente i protocolli sperimentali da seguire. Durante le lezioni frontali, sono previsti anche dei seminari su esempi pratici di applicazione delle diverse metodologie nell’ingegnerizzazione di enzimi per applicazioni biotecnologiche. La frequenza alle attività pratiche è con limite massimo delle assenze pari al 25% del programma.

L’esame è volto a valutare le capacità raggiunte dallo studente in relazione alla conoscenza e comprensione delle basi teoriche e delle applicazioni in campo biologico delle diverse metodologie preparative e analitiche trattate durante le parte teorica del Corso, mediante un esame scritto che prevede 3-4 domande a risposta aperta (2/3 del punteggio totale dell’esame) e 8-10 quesiti a risposta multipla (1/3 del punteggio totale dell’esame), da effettuarsi nel tempo di 90 minuti. La valutazione della comprensione delle problematiche affrontate durante le attività pratiche svolte in laboratorio, comprensive della capacità di comunicazione, presentazione, discussione e analisi critica dei risultati ottenuti, verrà effettuata sulla base della valutazione di una relazione stilata singolarmente da ogni studente al termine dei laboratori pratici. L’esito dell’esame sarà in trentesimi: entrambe le prove si ritengono superate se si raggiunge una votazione pari a 18/30. Il voto finale del Corso sarà la media aritmetica dell’esito delle singole prove.

- Bonaccorsi di Patti M.C., Contestabile R., Di Salvo M.L., Metodologie Biochimiche, Casa Editrice Ambrosiana.
- Stoppini M., Bellotti V., Biochimica Applicata, EdiSES.
- Wilson K., Walker J., Biochimica e Biologia Molecolare, Raffaello Cortina Editore.
- Slide lezioni: scaricabili dal sito E-learning.
- Attività pratiche in laboratorio: dispense fornite dal docente e slide scaricabili dal sito E-learning.

Orario di ricevimento: preferibilmente su appuntamento (mediante richiesta via e-mail). Il docente è disponibile ad incontri di approfondimento o di chiarimento per gruppi di studenti.

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A.A. 2018/2019

Anno di corso: 3
Curriculum: INDIRIZZO GENERALE

A.A. 2017/2018

Anno di corso: 3
Curriculum: BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI CELLULARI

A.A. 2016/2017

Anno di corso: 3
Curriculum: BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI CELLULARI