Università degli studi dell'Insubria

TECNOLOGIE RICOMBINANTI

A.A. di erogazione 2019/2020
Insegnamento opzionale

Laurea triennale in BIOTECNOLOGIE
 (A.A. 2017/2018)
Anno di corso: 
3
Tipologia di insegnamento: 
Affine/Integrativa
Settore disciplinare: 
GENETICA (BIO/18)
Lingua: 
Italiano
Crediti: 
6
Ciclo: 
Secondo Semestre
Ore di attivita' frontale: 
56
Dettaglio ore: 
Lezione (40 ore), Laboratorio (16 ore)

Il Corso di Tecnologie del DNA ricombinante è volto a fornire allo studente la conoscenza delle basi teoriche delle principali tecnologie di ingegneria genetica e degli approcci sperimentali basati sulle medesime.

In particolare, i risultati di apprendimento per il corso in oggetto prevedono:

- L’acquisizione delle competenze teoriche e operative nell’ambito delle principali tecnologie del DNA ricombinante (modulo di Tecnologie del DNA ricombinante).

- La capacità di elaborare un piano sperimentale nell’ambito della moderna ricerca in campo genetico e biologico-molecolare sulla base della conoscenza delle principali tecniche di manipolazione genetica (modulo di Tecnologie del DNA ricombinante).

- La capacità di acquisire una consapevole autonomia di giudizio e adeguate competenze e strumenti per la comunicazione con riferimento ai contenuti del corso, necessarie per elaborare e sostenere argomentazioni nel campo di studi relativo all’insegnamento stesso, sotto forma di competenza e padronanza della materia di studio tali da effettuare un ragionamento critico e risolvere problematiche relative alla disciplina inerente il corso.

- La capacità di mettere in pratica protocolli sperimentali di base nel corso delle attività di laboratorio didattico e al tempo stesso sviluppare le capacità di lavoro di gruppo.

Sono richieste solide conoscenze nell’ambito della Citologia e Istologia e della Genetica

MODULO FRONTALE DI TECNOLOGIE RICOMBINANTI (5 CFU, 40 ore)

• Il DNA come molecola informazionale (2 ore)
• Strategie di clonaggio molecolare: riepilogo (2 ore)
• Strategie di clonaggio indipendenti dalla DNA ligasi (1 ora)
• Vettori di clonaggio plasmidici di seconda e terza generazione. (2 ore)
• Vettori di clonaggio lambda e P1, cosmidi, vettori PAC, YACs e BACs. Vettori virali (2 ore)
• Saggi di ibridazione: teoria (1 ora)
• Applicazioni dei saggi di ibridazione-1: Southern, northern e zoo blot. Ibridazione su colonie ricombinanti (2 ore)
• Applicazioni dei saggi di ibridazione-2: FISH, RNA ISH, CGH, ibridazione su microarray (2 ore)
• Applicazioni della PCR: mutation screening e detection, screening di librerie, RT-PCR, clonaggio mediante PCR, DOP-PCR. (2 ore)
• Real-time PCR e Digital PCR: aspetti teorici e applicazioni (2 ore)
• Amplificazione del genoma tramite PCR: DOP-WGA e Multiple Displacement Amplification (MDA) (2 ore)
• Introduzione alle librerie genomiche. Modalità di costruzione, complessità di una libreria. Librerie a cDNA (2 ore)
• Approcci di mutagenesi. (2 ore)
• Saggi di trasferimento genico in cellule eucariotiche (1 ora).
• Metodi per la definizione delle regioni regolative di un gene: Siti di ipersensibilità alla DNAsi, saggi di trasferimento genico con geni reporter, DNA footprinting, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), Chromatin conformation Capture (CCC) (3 ore)
• Introduzione agli organismi transgenici. Metodi per la produzione e l’analisi di organismi transgenici murini (2 ore)
• Sistemi transgenici ad espressione regolata (2 ore)
• Approcci di gene targeting. Gene “knock-out” e “knock-in” in sistemi modello murini. Analisi del fenotipo e metodi per il gene “knock-out” condizionale (3 ore)
• Tecniche di genome editing: zinc-finger nucleasi, TALEN e CRISPR/Cas9 (2 ore)
• Mappe genetiche e marcatori molecolari (2 ore)
• Tecniche di DNA profiling (1 ora)

MODULO DI LABORATORIO DI TECNOLOGIE RICOMBINANTI (1 CFU, 16 ore)

DESCRIZIONE DELL’ESPERIMENTO: subclonaggio di una sequenza codificante per proteina in un vettore di espressione in cellule di mammifero, per esprimere tale proteina come prodotto di fusione con GFP, sua trasfezione in una linea cellulare umana e analisi dell’espressione mediante microscopia a fluorescenza e mediante qPCR.
FASI DELL’ESPERIMENTO EFFETTUATO IN LABORATORIO:
• Digestione dell’inserto da subclonare e del vettore con gli opportuni enzimi di restrizione;
• analisi dei siti di restrizione con specifici programmi;
• elettroforesi su gel di agarosio;
• purificazione dei frammenti di DNA;
• ligation;
• Trasformazione dei prodotti di ligazione in cellule batteriche competenti;
• Colture batteriche solide e liquide;
• Estrazione e purificazione di DNA plasmidico;
• Trasfezione dei costrutti preparati in una linea cellulare umana mediante lipofezione;
• Osservazione delle cellule trasfettate al microscopio invertito a fluorescenza;
• qPCR dall’RNA estratto da cellule trasfettate e calcolo delle variazioni nell’espressione del trascritto target mediante quantificazione relativa, utilizzando la formula del 2ˆ-DeltaDelta Cq (Livak 2001).

Il corso prevede sia lezioni frontali (5 CFU) che esercitazioni di laboratorio (1 CFU).
Nelle ore di lezione frontale il trattamento degli argomenti è svolto con l’ausilio di presentazioni proiettate in aula, integrate dalla proiezione di filmati didattici. Il modulo di Laboratorio Didattico si terrà nel Laboratorio di Biologia Sperimentale situato al piano viola presso il Dipartimento di Biotecnologie e Scienze della Vita, in via JH Dunant 3 a Varese. Nel corso del modulo di laboratorio, ad ogni studente viene assegnata una postazione per lo svolgimento autonomo degli esperimenti. Viene inoltre fornito ad ogni studente un fascicolo per ogni singola esercitazione da svolgere. Nel corso del modulo di laboratorio è assicurata l’assistenza continua in aula da parte del docente e di uno o più esercitatori. Si ricorda agli studenti che la frequenza dei laboratori didattici è obbligatoria e che è consentita l’assenza solo per un numero di ore non superiori al 25% dello svolgimento del programma didattico di laboratorio. Gli studenti dovranno presentarsi alle lezioni di laboratorio didattico muniti di camice da laboratorio. Inoltre, gli studenti che presentino allergie o intolleranze a farmaci o altre molecole che possano essere presenti in un laboratorio di ricerca devono tassativamente informarne il docente prima dell’inizio del modulo didattico di laboratorio.

L’apprendimento viene verificato mediante un approfondito colloquio orale, finalizzato all’accertamento dell’acquisizione da parte dello studente delle conoscenze e delle abilità attese. Nel corso della prova di esame orale, è previsto l’accertamento della capacità di analisi critica e di autonomia di giudizio degli studenti sugli argomenti principali del corso. Inoltre sarà richiesta la conoscenza degli argomenti trattati a lezione, riassunti nel materiale didattico disponibile sul sito e-learning (non meno di 3 domande). In sede di esame potrà eventualmente essere richiesta allo studente la soluzione di un problema “brain training” scelto dal docente tra quelli inseriti nella piattaforma e-learning. In sede di esame orale è infine prevista la discussione di un esperimento svolto nel corso di Laboratorio didattico. Il giudizio finale comporta l’attribuzione di un voto finale espresso in trentesimi e terrà conto dell’esattezza e della qualità delle risposte (70%), della capacità di motivare adeguatamente affermazioni, analisi e giudizi (20%) e dell’abilità comunicativa mostrata durante il colloquio (10%). La durata media di un esame è di 20-25 minuti e il voto è espresso in trentesimi: l’esame è superato con un punteggio di almeno 18/30.

Si consiglia la consultazione di uno dei seguenti testi:
1) Watson/Caudy/Myers/Witkowski “DNA ricombinante” – Zanichelli.
2) Maccarone M. “Metodologie biochimiche e biomolecolari” Zanichelli
3) Strachan-Read “Genetica molecolare umana” Zanichelli

Può essere prevista l’adozione di altri libri di testo per consultazione, la cui scelta è soggetta a variazione a seconda dell’introduzione di novità editoriali sul mercato dei testi universitari.
Il materiale didattico per le lezioni frontali di questo corso viene periodicamente aggiornato e consiste nelle slides che vengono presentate a lezione dal docente, nei supporti audiovisivi proiettati in aula e in articoli scientifici inerenti gli argomenti trattati a lezione. Tutto il materiale didattico sopracitato viene messo a disposizione degli studenti sulla piattaforma e-learning e saranno inoltre inseriti sulla piattaforma e-learning esercizi di “brain training” inerenti un argomento trattato a lezione.
Per il modulo di laboratorio, vengono fornite schede tecniche e fascicoli con il programma sperimentale delle singole sessioni, eventualmente integrati da articoli scientifici.

I docenti sono disponibili ad approfondire gli argomenti trattati a lezione previo appuntamento via e-mail (francesco.acquati@uninsubria.it; paola.campomenosi@uninsubria.it)

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A.A. 2019/2020

Anno di corso: 3
Curriculum: INDIRIZZO GENERALE

A.A. 2018/2019

Anno di corso: 3
Curriculum: INDIRIZZO GENERALE

A.A. 2016/2017

Anno di corso: 3
Curriculum: BIOTECNOLOGIE SANITARIE
Anno di corso: 3
Curriculum: BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI CELLULARI

A.A. 2015/2016

Anno di corso: 3
Curriculum: BIOTECNOLOGIE SANITARIE
Anno di corso: 3
Curriculum: BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI CELLULARI