Università degli studi dell'Insubria

PROTEIN ENGINEERING

A.A. di erogazione 2018/2019
Insegnamento obbligatorio

 (A.A. 2017/2018)
Anno di corso: 
2
Tipologia di insegnamento: 
Caratterizzante
Settore disciplinare: 
BIOCHIMICA (BIO/10)
Crediti: 
6
Ciclo: 
Primo Semestre
Ore di attivita' frontale: 
48
Dettaglio ore: 
Lezione (48 ore)

Obiettivi dell’insegnamento e risultati di apprendimento attesi
Presentazione e Obiettivi formativi
L’insegnamento di Ingegneria Proteica e Proteine Ricombinanti è parte fondamentale della formazione molecolare avanzata del laureato in BMI. Il corso ha l’obiettivo di spiegare i meccanismi molecolari alla base del rapporto struttura-funzione delle proteine e gli approcci sperimentali che permettono la modulazione della funzionalità proteica e l’acquisizione di funzioni/strutture desiderate.
Il corso si propone di fornire le conoscenze delle diverse tecniche che vengono applicate nell’ingegneria di proteine ad applicazione biotecnologica: progettazione ex novo di strutture proteiche, disegno razionale per la progettazione di nuove funzioni, modelling molecolare e docking, mutagenesi (sito-diretta e casuale) nonché dei metodi attraverso i quali è possibile isolare le varianti proteiche ottimizzate in una determinata proprietà. Inoltre verranno presentati i diversi sistemi di espressione utilizzati nella produzione di proteine ricombinanti di diversa provenienza. Gli studenti saranno stimolati a valutare quali siano i vantaggi e i limiti dei vari approcci di modificazione delle proprietà delle proteine e quelli connessi all’utilizzo dei diversi sistemi di espressione eterologa. Verranno discusse le scelte operate nel caso della produzione di diverse proteine portate quali casi di studio. Il corso prevede una serie di esercitazioni di laboratorio che ripercorrono sperimentalmente i contenuti teorici delle lezioni.
Ci si attende che gli studenti apprendano le nozioni che permetteranno loro di acquisire capacità decisionali in un progetto di “protein engineering”, dalla fase di progettazione a quella della produzione delle varianti proteiche ricombinanti, e di saper affrontare e risolvere le diverse problematicità legate al processo.

Risultati di apprendimento attesi
Conoscenza e capacità di comprensione:
- acquisire gli elementi fondamentali a livello molecolare del rapporto struttura-funzione delle proteine
- possedere le informazioni necessarie (teoriche e sperimentali) per affrontare criticamente un processo di ingegnerizzazione della funzionalità e stabilità di una proteina

Capacità di applicare conoscenza e comprensione:
- saper applicare le conoscenze acquisite di biochimica e di biologia molecolare a un progetto di ingegneria proteica
- nell’abilità a cogliere le interconnessioni tra strutture e funzionalità nella loro interdipendenza e regolazione

Autonomia di giudizio:
- abilità a comprendere e discutere criticamente gli approcci sperimentali per ingegnerizzare una struttura proteica
- capacità di proporre approcci sperimentali innovativi

Abilità comunicative:
- dimostrare capacità di estrarre e sintetizzare l'informazione rilevante
- dimostrare di saper comunicare in maniera efficace sia oralmente che in forma scritta
- dimostrare abilità di riassumere e presentare l'informazione (anche in termini matematici e grafici).

Capacità di apprendimento:
- capacità di leggere, comprendere e commentare un testo scientifico di biochimica strutturale, anche in lingua inglese
- abilità ad utilizzare queste conoscenze per valutare criticamente gli obiettivi e/o i risultati di un progetto di ricerca secondo sia l’approccio quantitativo che qualitativo.

Lo studente che accede a questo corso possiede conoscenze di: Biochimica generale, soprattutto deve possedere solide nozioni riguardanti la struttura e proprietà delle proteine; Biologia Molecolare, con particolare riferimento alle tecniche di manipolazione, clonaggio e amplificazione del DNA; Microbiologia. Per le esercitazioni in laboratorio, è bene che lo studente possieda le abilità pratiche e le conoscenze metodologiche acquisite durante il corso di Metodologie Biochimiche.

Contenuti e programma del corso

Modulo “Ingegneria Proteica” – docente L.Pollegioni: 6 CFU – 48 ore frontali
Rapporto struttura e funzione nelle proteine – 4 CFU (32 ore)
- Introduzione alla struttura della proteine
- Classificazione strutturale delle proteine
- La sintesi proteica: meccanismi e regolazione
- Metodi sperimentali e in silico di determinazione della struttura delle proteine
- Modifiche post-traduzionali e protein targeting
- Protein folding (in vitro e in vivo)
- Degradazione delle proteine (sistema lisosomiale e proteasomico)
- Proteine di membrana: rapporto struttura e funzione

Ingegneria Proteica: rational design – 2 CFU (16 ore)
- De novo protein design (di strutture e funzioni): metodi ed esempi
- Rational design: teoria e metodi sperimentali. Esempi
- Molecular docking: teoria ed esempi
- Ingegnerizzazione della stabilità delle proteine: teoria, metodi ed esempi

Modulo “Laboratorio di Proteine Ricombinanti” – docente Silvia Sacchi: 6 CFU – 32 ore frontali, 32 ore di laboratorio
Ingegneria Proteica: irrational design e screening – 1.5 CFU (12 ore)
- Irrational design: Directed evolution: metodi basati sull’omologia di sequenza
- Irrational design: metodi combinatoriali indipendenti dall’omologia di sequenza
- Selezione e Screening: procedure che consentono di valutare varianti enzimatiche generate e di isolare quelle ottimizzate per una determinata proprietà di interesse.

Produzione di proteine ricombinanti – 2.5 CFU (20 ore)
- Introduzione alla produzione di proteine ricombinanti
- Tecniche di clonaggio e vettori di espressione
- Sistemi “cell free” per l’espressione di proteine
- Espressione in sistemi procariotici (Gram negativi e Gram positivi)
- Espressione in E. coli
- Fermentazione di E. coli: ottimizzazione del processo con strumenti genetici e fisiologici.
- Strategie per aumentare l’espressione delle proteine solubili: procedure da adottare per minimizzare la formazione di corpi di inclusione
- Espressione in sistemi eucariotici: Pichia, Saccharomyces etc.
- Espressione in sistemi eucariotici: cellule di insetto e di mammifero.
- Criteri di scelta dell’ospite e discussione finale. Discussione aperta con gli studenti sui contenuti del corso.

Laboratorio: 32 ore
- Esercitazione 1 - Allestimento di reazioni di EP-PCR
- Esercitazione 2 - Screening di una libreria di mutanti attraverso un dosaggio di attività enzimatica.
- Esercitazione 3 - Prove di espressione - preparazione dei terreni, inoculo e monitoraggio delle prime fasi di fermentazione.
- Esercitazione 4 - Prove di espressione - monitoraggio della fermentazione, induzione e raccolta.
- Esercitazione 5 - Prove di espressione - rottura dei campioni, allestimento dosaggi della concentrazione proteica dei campioni, saggi di attività enzimatica, ricapitolazione e discussione dei risultati.

Tipologia delle attività didattiche
Il modulo “Ingegneria Proteica” (docente L. Pollegioni) consiste in 48 ore di lezioni frontali
Il modulo “Laboratorio di Proteine Ricombinanti” (docente S. Sacchi) consiste in 32 ore di lezioni frontali e seminari, e 32 ore di laboratorio.
Tutte le attività si svolgeranno in presenza del docente incaricato.

Testi e materiale didattico
Slide lezioni: scaricabili dal sito Elearning
Testi (uno a scelta):
Voet D, Voet JG, Pratt CW "Fondamenti di Biochimica" (Zanichelli)
Garette-Grisham "Principi di Biochimica" (PICCIN)
Matthews , Van Holde, Ahern, “Biochimica” (Casa Editrice Ambrosiana)
Branden C. e Tooze J., Introduction to protein structure (Garland Publ.)
Bross P. e Gregersen N. Protein misfolding and disease, Methods in Molecular Biology, vol. 232 (Humana Press).
Arnold F. H., Georgiou G. Directed Enzyme Evolution: Screening and Selection Methods (Methods in Molecular Biology) (Humana Press)
Arnold F. H., Georgiou G. Directed Evolution Library Creation: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Humana Press)

Modalità di verifica dell’apprendimento
L’esame è volto a valutare le capacità raggiunte dallo studente in relazione a:
1. conoscenza e comprensione delle basi teoriche del rapporto struttura-funzione nelle proteine e capacità di collegare i vari aspetti nell’argomentazione.
2. capacità di applicare le conoscenze acquisite per sviluppare un progetto di ingegneria proteica. Capacità di estrarre informazione da un testo scientifico e di individuare gli aspetti critici.
3. possesso di conoscenze di carattere quantitativo per descrivere a livello molecolare e matematico i fenomeni biologici.
L’esame consisterà in una prova scritta in cui lo studente sarà chiamato a dimostrare le conoscenze relative ai moduli “Ingegneria Proteica” e “Laboratorio di Proteine Ricombinanti” del programma. Per ogni modulo allo studente verranno somministrate 4 domande aperte (valutate ciascuna fino a 8 punti). L’attività di laboratorio sarà valutata attraverso la stesura di una relazione scientifica dettagliata delle attività svolte. L’esito dell’esame sarà in trentesimi: l’esame si ritiene superato con una votazione di almeno 18/30 in ciascun modulo e nella relazione di laboratorio. Il voto finale sarà la media aritmetica dell’esito delle tre prove.